目的探讨化学发光法检测维生素B12在巨幼细胞性贫血诊断中的应用效果。方法回顾性分析2023年1月至2025年12月淮安市第五人民医院收治的80例疑似巨幼细胞性贫血患者的临床资料，另选取同期30例健康体检者作为对照组，所有研究对象均通过化学发光法检测维生素B12，并以综合诊断结果为金标准，分析诊断效果。结果化学发光法检测维生素B12诊断巨幼细胞性贫血的灵敏度为91.49%（43/47），特异度为96.97%（32/33）；巨幼细胞性贫血组平均红细胞体积高于非巨幼细胞性贫血组和对照组，血红蛋白及维生素B12低于非巨幼细胞性贫血组和对照组（P＜0.05）；综合诊断结果和化学发光法检测维生素B12结果一致性较好（P＜0.05）。结论化学发光法检测维生素B12诊断效果理想，可用于辅助鉴别巨幼细胞性贫血，有推广价值。